Microdissecteur Laser

La Microdissection par Capture Laser (LCM) permet la capture spécifique de groupes de cellules à partir de coupes de tissus congelés ou inclus en paraffine. Depuis 10 ans nous avons développé notre compétence en microdissection sur des modèles très variés : humains, animaux et végétaux. Nous disposons depuis le début de l'année 2018, suite à un financement FEDER, d'un deuxième microdissecteur par capture laser : Le XT (Arcturus). Il vient compléter notre Veritas de la même marque. Dans la plupart de nos réalisations, l'objectif était d'obtenir des ARN des cellules que nous avions capturées pour réaliser une étude du transcriptome de ces cellules. Nous avons une grande expertise dans le domaine de la microdissection single cell jusqu'à la préparation d'ARN de qualité via l'amplification linéaire des transcripts.

Nouveau microdissecteur
  1. Présentation
  2. Capture d'Ectocarpus (Algues brunes)
  3. Capture d'hépatocytes en coculture
  4. Graine de colza
  5. Capture de Lymphocytes B dans les glandes salivaires secondaires
  6. capture dans Lichina Pigmaea
  7. capture du stroma dans le cholangiocarcinome
  8. capture de ionocytes dans la branchie de truite

Présentation

Microdissecteur Laser-1

Le système utilise un laser Infra rouge (IR) de basse énergie permettant d'activer un film thermo-sensible se trouvant au dessus des cellules ou du tissu d'intérêt.
Cet appareil possède également un laser UV permettant la dissection rapide de larges zones de tissus.
 
Des capsules spécialement développées sont coatées avec ce film. Une fois positionné au dessus des zones d'intérêts, l'appareil dirige le laser IR à travers la capsule pour coller le film sur les cellules d'intérêts. Lorsque la capsule est soulevée les cellules fixées au film thermosensible sont arrachées spécifiquement du tissu. La capsule peut être placée directement dans un microtube contenant la solution de lyse pour en extraire l'ADN, l'ARN ou les protéines.

A titre d'exemple : Nos premiers travaux nous ont permis de récupérer 100ng d'ARN à partir d'un prélèvement d'1mm2 d'une coupe de tissu congelé de 10µm.
La capture est effectuée sur coupes de tissus, de quelques microns, congelés coupés au cryostat ou inclus en paraffine coupés au microtome. Les coupes sont déposées sur lames de verre ou sur films plastiques. La reconnaissance des cellules d'intérêt est obtenue par coloration ou par immuno-histochimie. Des étapes de déshydratation permettent d'une part la protection des ARNs en bloquant l'action des RNAses mais également l'adhérence des cellules ciblées.
 
Equipement financé avec le soutien de l'Association de recherche contre le Cancer (ARC)et la Ligue 
 

Capture d'Ectocarpus (Algues brunes)

capture laser d'ectocarpus - le laser UV permet de couper la micro algue et le laser IR de récupérer le fragment.

Avec suzana Coelho (CNRS Roscoff) nous avons mis au point la capture de l'algue brune Ectocarpus pour en purifier les ARNs. Cette capture nécessite au préalable la coupe, au laser Ultra Violet, des embranchements avant capture par le laser infra rouge.

Capture d'hépatocytes en coculture

capture de cellules en culture - capture d'hépatocytes de souris dans une coculture

Nous avons été solicité par l'équipe d'Olivier Loréal (NUMECAN) pour capturer spécifiquement, afin de réaliser une analyse protéomique, les cellules hépatocytaires dans une coculture d'hépatocytes de souris et de cellules épithéliales billiaires. Après deshydratation les cellules ont été capturées par le laser Infra rouge. Nous pouvons voir sur ces images la spécificité de la capture.
 
 

Graine de colza

microdissection laser appliquée à la graine de colza

Problématique :
En colaboration avec l'équipe de Nathalie Nési (INRA-AgroCampus de Rennes), nous avons optimisé les conditions de prélèvement par capture laser des différents tissus de jeunes graines de Colza. Le but de cette étude concerne :
- la mise en évidence de transcrits de gènes impliqués dans le métabolisme des tanins dans les téguments de jeunes graines de colza.
- la recherche des métabolites des tannins dans les téguments internes et externes des jeunes graines de colza.
 
Méthodologie :
Capture par microdissection laser des différents téguments dans des graines de colza entre 5 et 40 jours après pollinisation.
La congélation des graines de colza étant impossible (destruction des constituants de la graine). Nous avons dû utiliser la technique de fixation et d'imprégnation en paraffine. Pour limiter la destruction des ARN nous avons réalisé la fixation avec du RCL2 (solution à base d'alcool et d'acide acétique sans formaldéhyde).
La structure des graines de colza nécessite, préalablement à la capture, une fixation sous pression au RCL2 puis une inclusion en paraffine. Des coupes au microtome de 10µM permettent après déparaffinage une capture des différents types de téguments interne et externe. 
   
Les préparations d'ARN sont faites sur la plate-forme. L'identification des métabolites sera faite sur la plate-forme protéomique Ouest Génopole de Rennes par nanoHPLC.
 

 

Capture de Lymphocytes B dans les glandes salivaires secondaires

capture de lymphocytes B - identification en fluyorescence avant capture

La thématique de Jacques-Olivier Pers (Inserm, Brest) concerne l'étude d'une maladie autoimmune : le syndrome de Gougerot Joegren. Nous avons pu, à partir de glandes salivaires secondaires congelées, réaliser des coupes fines et  mettre en évidence les lymphocytes B par immunomarquage fluorescent pour rapidement les capturer et extraire les ARN pour une étude par qPCR. le challenge était de pouvoir marquer les cellules sans dégrader les ARNs. Les échantillons étant extremement précieux puisque provenant de malades. Ces travaux ont été publiés dans journal of immunology.

capture dans Lichina Pigmaea

capture des agues dans le lichen

En collaboration avec le Pr Boustie de l'Université de Rennes 1, nous avons réalisé des captures laser sur des coupes de lichen frais. La fluorescence naturelle de la chlorophyle nous a permis de bien différencier les algues des champignons. Nous avons ainsi pu réaliser la capture laser specifique qui a permis ensuite des études en protéomique.
 

capture du foie de larves de zebrafish

Normand Podechard (UR1, Inserm IRSET) étudie l'impact toxicologique du Benzo[a]pyrene en utilisant comme modèle des zébrafish de 7 jours. L'impact de ce polluant se situe au niveau du foie. Nous avons donc capturé, à partir de ces poissons congelés puis coupés au cryostat, par microdissection laser les foies qui étaient difficile à reconnaitre. 

capture du stroma dans le cholangiocarcinome

capture du stroma de cholangiocarcinome

Dans cette étude avec le Pr Laurent Sulpice (CHU Rennes, Inserm NuMeCan) nous avons capturé specifiquement les stromas de cholangiocarcinome pour mettre en évidence par transcriptomique des biomarqueurs de l'agressivité tumorale. Nous avons validé ces biomarqueurs par IHC grâce à des TMA. Ces travaux ont été publiés dans Hepatology.

capture de ionocytes dans la branchie de truite

capture de ionocytes dans la branchie de truite

Isabelle Leguen (INRA LPGP) s'intéresse à la régulation osmotique des truites lors du passage de l'eau douce à l'eau de mer. Les ionocytes fortement impliqués dans cette régulation sont localisés au niveau des branchies. Nous avons donc mis en évidence ces cellules par Immuno fluorescence pour les capturer cellule à cellule (single cell) et réaliser une étude de la variation du transcriptome en fonction de l'environnement du poisson.
Nous avons levé quelques verrous lors de cette étude : l'immuno fluo sans dégrader les ARN, l'amplification linéaire des ARN de 400 cellules pour pouvoir faire une puce en transcriptomique. Ces travaux ont été publiés dans PlosOne.