• Publié par : Alain Fautrel
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Quelques exemples

Avec suzana Coelho (CNRS Roscoff) nous avons mis au point la cupture de l'algue brune Ectocarpus pour en purifier les ARNs. Cette capture nécessite au préalable la coupe, au laser Ultra Violet, des embranchements avant capture par le laser infra rouge

 

lame après capture                     visualisation des captures

En collaboration avec l'équipe de Jacques-Olivier Pers (Université de Brest). Nous avons mis au point la capture  spécifique de lymphocytes dans les glandes salivaires.  Notre objectif étant de capturer spécifiquement  les infiltrats de lymphocytes B, pour cela nous avons soit utilisé un marquage colorimetrique avec une identification préalable des lymphocytes B par immunomarquage fluorescent (CD20),

 

 

soit par capture directe après identification des lymphocytes par immunofluorescence           

A partir d'une coculture d'hépatocytes de souris et de cellules épithéliales billiaires, nous avons été solicités par l'équipe d'Olivier Loréal (Inserm U522) pour capturer spécifiquement les cellules hépatocytaires  pour une analyse  de protéomique. Après déshydratation, les cellules ont été capturées.

 

  coculture d'hépatocytes et cellules épithéliales aprés coloration  coculture aprés capture d'hépatocytes  hépatocytes après capture laser IR et UVSur film plastique
           
coculture d'hépatocytes et de cellules épithéliales - capture laser UV et IR des hépatocytes
 
 
 
 
Sur lame de verre  coculture d'hépatocytes et cellules hépithéliales deshydratée  patch du film plastique sur les hépatocytes par laser IR
Coculture après capture des hépatocytes  cap contenant les hépatocytes capturés
 
capture IR des hépatocytes dans une coculture
 

 

problématique :

En colaboration avec l'équipe de UMR118 INRA-AgroCampus Rennes de Nathalie Nési, nous avons optimisé les conditions de prélèvement par capture laser des différents tissus de jeunes graines de Colza. Le but de cette étude concerne :

- la mise en évidence de transcrits de gènes impliqués dans le métabolisme des tanins dans les téguments de jeunes graines de colza

- la recherche des métabolites des tannins dans les téguments internes et externe des jeunes graines de colza.

 

methodologie :

capture par microdissection laser des différents téguments dans des graine de colza entre 5 et 40 jours après polenisation.

La structure des graines de colza nécessite préalablement à la capture une fixation sous pression au RCL2 puis une inclusion en paraffine. Des coupes au microtome de 10µM permettent après déparaffinage une capture des différents types tissulaires. Les essais sur graines congelées à l'azote liquide n'ont pas permis une bonne conservation des structures.

        

         graine congelée                        graine fixée en paraffine

Les préparation d'ARN sont faite sur la plate-forme . L'identification des métabolites sera faite sur la plate-forme protéomique Ouest Génopole de Rennes par nanoHPLC.

 

  

 

Notre LCM (laser capture microdissection) nous permet de capturer des cellules isolées dans un tissu. Dans notre exemple nous avons capuré des cellules germinales dans le testicule de souris fixé au RCL2 et inclus en paraffine

 

 

 

 

 

 

 

visualisation des cellules capturées dans le cap.

 

Microdissection laser (LCM)

 

 

 

 

Le VERITAS (Arcturus) permet la capture spécifique de groupes de cellules à partir de coupes de tissus congelées ou inclus en paraffine et également la capture de cellules en culture.


Le système utilise un laser Infra rouge (IR) de basse énergie permettant d'activer un film thermo-sensible se trouvant au dessus des cellules ou du tissu d'intérêt.

Cet appareil possède également un laser UV permettant la dissection rapide de larges zones de tissus.

 

Des capsules spécialement développées sont coatées avec ce film. Une fois positionné au dessus des zones d'intérêts, l'appareil dirige le laser IR à travers la capsule pour coller le film sur les cellules d'intérêts. Lorsque la capsule est soulevée les cellules fixées au film thermosensible sont arrachées spécifiquement du tissu. La capsule peut être placée directement dans un microtube contenant la solution de lyse pour en extraire l'ADN, l'ARN ou les protéines.


A titre d'exemple : Nos premiers travaux nous ont permis de récupérer 100ng d'ARN à partir d'un prélèvement d'1mm2 d'une coupe de tissu congelé de 10µm.

La capture est effectuée sur coupes de tissus de quelques microns, provenant de tissus congelés coupés au cryostat ou de tissus inclus en paraffine coupés au microtome. Les coupes sont déposées sur lames de verre ou sur films plastiques. La reconnaissance des cellules d'intérêt est obtenue par coloration ou par immuno-histochimie. Des étapes de déshydratation permettent d'une part la protection des ARNs en bloquant l'action des RNAses mais également l'adhérence des cellules ciblées.

 

 

Equipement financé avec le soutien de l'Association de recherche contre le Cancer (ARC)et la Ligue contre le cancer